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Les laboratoires centraux qui offrent une variété de services de séquençage de nouvelle génération (NGS) associés à un large éventail de clients, de types d'échantillons et de méthodes de séquençage doivent trouver un équilibre entre l'efficacité de leurs flux de travail NGS et la qualité des données qu'ils génèrent. Alors que le coût du séquençage diminue, les coûts associés à la préparation des librairies commencent à représenter une part importante des coûts globaux du flux de travail NGS. Pour résoudre ce problème de coût majeur du séquençage, de nombreuses organisations ont suivi la tendance à la miniaturisation des réactions, réduisant effectivement les volumes de réaction au volume recommandé par le fabricant, à savoir 10%.
Cette note d'application présente un flux de travail permettant de générer des librairies NGS de haute qualité à l'aide d'une distribution microfluidique précise de réactifs par déplacement positif, même avec une faible quantité de cellules. Les données de contrôle de la qualité d'une préparation de librairie Illumina Nextera XT d'un quart de volume démontrent l'applicabilité et l'efficacité de la miniaturisation des réactions dans le contexte du séquençage de cellules uniques.
Matériau.
- Plaque Eppendorf twin.tec 384 (PN 0030129342)
- Kit de préparation de librairies d'ADN Illumina Nextera XT (PN FC-131-1096)
- Kit d'indexation Illumina Nextera XT V2 (FC-131-2001)
- thermocycleur
- Processeur de liquide FORMULATRIX® MANTIS® (PN MANTV3.2)
- Alpaqua 384 Column Magnetic Plate (PN A001222)
- ThermoFisher Qubit 4 Fluoromètre (PN Q33226)
- Bioanalyseur Agilent 2100 (PN G2939BA)
les méthodologies
Préparation de librairies Illumina Nextera XT d'un quart de volume
Huit échantillons d'ADNc de cellules neuronales de souris (trois types de cellules ; 1 ng d'ADN d'entrée) ont été utilisés dans ce projet pilote, et la qualité des bibliothèques générées dans des quarts de volume a ensuite été évaluée par le protocole expérimental suivant :
**A. Tagment cDNA - volume total de la réaction 6,35 µL **
Ajouter 1,25 µl d'ADN d'entrée dans les puits d'une plaque de microtitration à 384 puits.
Aspirer le TD Buffer dans une pointe de pipette de 200 µl* et le placer sur la puce LV du MANTIS. Distribuer 2,5 µl de TD Buffer dans chaque puits de la microplaque MANTIS contenant l'échantillon.
Mélange.
Pipeter l'ATM dans une pointe de pipette de 200 µl* et la placer sur la puce LV du MANTIS. Distribuer 1,3 µL d'ATM dans chaque puits contenant l'échantillon sur la microplaque MANTIS.
Mélange.
Cyclage thermique.
i. Maintenir à 55°C pendant 5 minutes
ii. 10°C à tout moment par la suite
Pipeter le NT Buffer dans une pointe de pipette de 200 µl* et la placer sur la puce LV du MANTIS. Distribuer 1,3 µl de NT Buffer dans chaque puits de la microplaque MANTIS contenant l'échantillon.
Mélange.
Incuber à température ambiante pendant 5 minutes.
B. Amplification de la librairie - Volume total de réaction de 12,65 µl
Aspirer le NPM dans une pointe de pipette de 200 µl* et le placer sur la puce LV du MANTIS. Distribuer 3,8 µL dans chaque puits contenant l'échantillon sur la microplaque MANTIS.
Pipeter manuellement 1,25 µl des deux amorces d'index dans l'échantillon afin d'obtenir une combinaison unique d'amorces d'index pour chaque échantillon.
Mélange.
Cyclage thermique.
i. 3 minutes à 72°C
ii. 30 secondes à 95°C
iii. effectuer les 12 cycles suivants
a. 10 secondes à 95°C
b. 30 secondes à 55°C
c. 30 secondes à 72°C
iv. 5 minutes à 72°C
v. 10°C en permanence
C. Nettoyage de la bibliothèque
1) Inhaler les microbilles AMpure XP dans une pointe de pipette de 200 µL* et les placer sur la puce HV du MANTIS. Distribuer 10 µL dans chaque puits contenant l'échantillon sur la microplaque MANTIS.
2. le mélange.
3. incuber à température ambiante pendant 5 minutes
4) Placer la plaque sur l'aimant et attendre 2 minutes.
5) Retirer manuellement tout le surnageant (ne pas retirer la microplaque de l'aimant avant l'étape 11).
6) En utilisant l'option Continuous Flow Function du MANTIS, ajouter 50 µl de 80% EtOH à chaque puits contenant l'échantillon sur la microplaque.
7) Incuber pendant 30 secondes.
8) Retirer manuellement tout le surnageant tout en plaçant la microplaque sur l'aimant.
9. répéter les étapes 6 à 8. 1. sécher à l'air libre pendant 15 minutes. 2. 2 Retirer la microplaque de l'aimant. 3. 3) Pipeter le RSB dans une pointe de pipette de 200 µl* et le placer sur la puce HV du MANTIS. 4) Distribuer 15 µl dans chaque puits contenant l'échantillon sur la microplaque MANTIS. 4) Distribuer 15 µl dans chaque puits contenant l'échantillon sur la microplaque MANTIS. 5) Mélanger. 6) Incuber à température ambiante pendant 2 minutes. 7) Placer la microplaque sur un aimant. 8) Incuber à température ambiante pendant 2 minutes. 8 Incuber pendant 2 minutes. 9. transférer manuellement 12,5 µl des billes dans une nouvelle microplaque.
D. Volume d'inhalation = volume distribué par échantillon x nombre d'échantillons + facteur de sécurité 10%. Utiliser des pointes de pipette de 1000 µl pour les volumes d'inhalation supérieurs à 200 µl.
Résultats.
La qualité des librairies Nextera a été évaluée pour chaque échantillon par le suivi Agilent BioAnalyzer.
Figure 1 : Trace Bio nalyzer de huit librairies de séquençage de nouvelle génération préparées à partir de huit échantillons uniques d'ADNc de cellules neuronales de souris de 1 ng.
Résumé.
Selon le suivi des données du BioAnalyzer, la composition des bibliothèques préparées par la miniaturisation des réactions en quart de volume est acceptable et comparable à celle des bibliothèques préparées selon les protocoles expérimentaux en plein volume.
La préparation de librairies dans un quart du volume peut entraîner des économies significatives de 75% sur le coût du kit par réaction. Le processeur liquide MANTIS® pour FORMULATRIX® facilite la miniaturisation des réactions grâce à une distribution microfluidique précise des réactifs dans des volumes aussi faibles que 100 nL, et il est sans consommable, simple d'utilisation et fiable.
Source : @BostonFummerle
Date : 10 février 2022