MANTIS® Dispenserを用いた臓器移植における自動化された再現性の高いHLA抗体スクリーニングについて

コンテキスト

ヒト白血球抗原（HLA）システムは、我々の適応免疫系の一部であり、疾病防御と臓器移植の両方において重要な役割を果たしている。レシピエントと一致するHLAマーカーを持つドナーは、臓器を拒絶する可能性が低い。

オランダにあるラドバウド大学医療センターの医療免疫学研究室（LMI）の研究者たちは、臓器提供者候補の血清からHLA特異的抗体をスクリーニングしている。HLAマーカーに対する抗体の検出は、ドナー臓器の超急性拒絶反応を避けるために必要である。拒絶反応は輸血、移植、妊娠によって引き起こされることがある。当研究所では、患者血清中のこれらの有害な抗体を検出するため、四半期ごとにスクリーニングを行っている。

これらの抗体は、患者の血清とHLAマーカーの異なる60人以上のリンパ球懸濁液をクロスマッチングさせることによって検出することができる。これは補体依存性細胞毒性（CDC）検査とも呼ばれます。

この研究では、FORMULATRIX®社のMANTIS® Liquid Processorを使用して、調製した寺崎プレートに分離リンパ球を分配した。

材料と方法

まず、ART Robbins (Sunnyvale, CA)の血清分注機を用いて、1μlの患者血清をテラサキプレート（Greiner）に分注した。密度勾配Lymphoprep（Elitech Group）または液体窒素法を用いて血液からドナーリンパ球を分離し、CFDA C195（Invitrogen）色素で培養・洗浄した。その後、1mlあたり4×106個のリンパ球懸濁液を調製する。

MANTIS® Dispenserを使用して、1μLの単離リンパ球を準備したテラサキプレートに分注した。その後、ウサギ補体（Immucore, Norcross, GA）、EDTA（Merck, KGaA, Darmstadt, Germany）、ヘモグロビン、ヨウ化プロピジウムの懸濁液を加え、インキュベートした。

最終添加工程の後、マイクロタイタープレートを倒立蛍光顕微鏡（Leitz Leica Diavert Inverted Microscope withfluorescent light illuminator (480-525nm) Oculair 10x）で観察し、患者の血清とドナーのリンパ球との間に陽性反応または陰性反応があるかどうかを判定した。患者の血清とドナーのリンパ球の間に陽性反応または陰性反応があるかどうか。

殺滅率（% kill）の測定は、蛍光染色の結果から決定される（図1参照）。殺傷率とは、陽性細胞と陰性細胞の総数（緑）に対する陽性細胞（赤）の割合である。パーセントスコアを表1に示す。

表1：キルスコアの割合

図1：はっきり見えるリンパ球サンプル (A)陰性反応、緑色。 (B）陽性反応、赤色。 (C）強い陽性反応、赤色。

結果と結論

既存の装置がサポートされなくなったため、研究室は、調製したリンパ球をテラサキプレートに添加するための代替の自動ディスペンサーを見つけなければならない。手作業による分注は、実験中にばらつきが生じ、研究者にとっては受け入れがたいものである。

HLAスクリーニングのために、もはやサポートされていない機器を使用している研究室の数は増え続けており、この時代遅れの技術を交換する必要があるため、LMIのチームは、この重要な仕事に携わっているより広い学術界のために、評価結果を共有することに同意した。

FORMULATRIX社のMANTIS装置は、手動ピペット添加に比べ、リンパ球添加の優れた技術として認められており、ルーチンの検査室ワークフローで成功裏に使用されている。より短時間で、より一貫性のある正確な結果が得られます。

謝辞と謝辞

FORMULATRIX® は、MANTIS® Dispenser の HLA ワークフローを評価し、本アプリケーションノートにデータ結果を提供してくださった Yvonne van Berkel 氏（Senior Analyst Cellulaire Immunologie en Histocompatibiliteit）と LMI チームに感謝いたします。本アプリケーションノートに記載されたデータ結果の説明。チームの他のメンバーは、Siham Akdimi、Gaby Derksen、Suzanne Hendriks、Jeroen Slager でした。

出典：@BostonFummerle

時間：2022.02.21