MANTIS® 디스펜서를 사용하여 장기 이식에서 자동화되고 재현 가능한 HLA 항체 스크리닝을 수행합니다.
컨텍스트
인간 백혈구 항원(HLA) 시스템은 적응 면역 체계의 일부이며 질병 방어와 장기 이식 모두에서 중요한 역할을 합니다. 수혜자와 일치하는 HLA 마커를 가진 기증자는 장기를 거부할 가능성이 적습니다.
네덜란드 라드바우드 대학 메디컬 센터의 의료면역학 연구소(LMI)의 연구원들이 잠재적 장기 기증자의 혈청에서 HLA 특이 항체를 검사하고 있습니다. 기증 장기에 대한 초급성 거부 반응을 피하기 위해 HLA 마커에 대한 항체 검출이 필요합니다. 거부반응은 수혈, 이식 또는 임신으로 인해 발생할 수 있습니다. 실험실에서는 환자 혈청에서 이러한 유해한 항체를 검출하기 위해 분기별로 검사를 실시합니다.
이러한 항체는 환자의 혈청을 서로 다른 HLA 마커를 가진 60개 이상의 고유한 림프구 현탁액과 교차 매칭하여 검출할 수 있습니다. 이를 보체 의존성 세포 독성(CDC) 검사라고도 합니다.
이 연구에서는 분리된 림프구를 준비된 테라사키 플레이트에 분배하기 위해 포뮬라트릭스®의 MANTIS® 액체 처리기를 사용했습니다.
자료 및 방법
먼저, 1 μl의 환자 혈청을 ART Robbins(캘리포니아 서니베일) 혈청 디스펜서를 사용하여 Terasaki 플레이트(Greiner)에 디스펜싱했습니다. 기증자 림프구를 밀도 구배 Lymphoprep(엘리텍 그룹) 또는 액체 질소 방법을 사용하여 혈액에서 분리한 다음 배양하고 CFDA C195(Invitrogen) 염료로 세척했습니다. 그런 다음 ml당 4 x 106 세포의 림프구 현탁액을 준비합니다.
MANTIS® 디스펜서를 사용하여 분리된 림프구 1μL를 준비된 테라사키 플레이트에 디스펜싱했습니다. 후속 단계에는 토끼 보체(Immucore, Norcross, 조지아주 소재)와 EDTA 현탁액(Merck, KGaA, 독일 담스타트 소재), 헤모글로빈 및 요오드화 프로피듐을 첨가하고 배양하는 것이 포함되었습니다.
마지막 추가 단계 후, 역형광 현미경(라이츠 라이카 다이아버트 역형광 현미경, 형광 조명기(480-525nm) Oculair 10x)으로 마이크로티터 플레이트를 관찰하여 환자 혈청과 기증자 림프구 사이에 양성 또는 음성 반응이 있는지 확인합니다. 환자 혈청과 기증자 림프구 사이에 양성 또는 음성 반응이 있는지 확인합니다.
형광 염색 결과에서 사멸률(% 사멸) 측정값을 확인할 수 있습니다(그림 1 참조). 사멸률은 총 양성 및 음성 세포 수(녹색) 대비 양성 세포 수(빨간색)의 백분율입니다. 백분율 점수는 표 1에 나와 있습니다.
표 1: 킬 점수 백분율
그림 1: 명확하게 보이는 림프구 샘플 (A) 음성 반응, 녹색. (B) 양성 반응, 빨간색. (C) 강한 양성 반응, 빨간색.
결과 및 결론
기존 장비가 더 이상 지원되지 않기 때문에 실험실에서는 준비된 림프구를 테라사키 플레이트에 추가하기 위한 대체 자동 디스펜서를 찾아야 합니다. 수동 디스펜싱은 실험 중에 다양한 변수가 발생하기 때문에 연구자가 감당할 수 없습니다.
더 이상 지원되지 않는 장비를 사용하여 HLA 스크리닝을 하는 실험실의 수가 증가함에 따라 이 구식 기술을 교체해야 할 필요가 있기 때문에 LMI 팀은 이 중요한 작업에 관련된 더 넓은 학계의 이익을 위해 평가 결과를 공유하기로 동의했습니다.
포뮬라트릭스의 MANTIS 기기는 수동 피펫 추가에 비해 우수한 림프구 추가 기술로 인정받고 있으며 일상적인 실험실 워크플로우에서 성공적으로 사용되고 있습니다. 이 기기는 더 짧은 시간에 더 높은 일관성과 정확도로 결과를 제공합니다.
감사 및 인정
포뮬라트릭스®는 이 애플리케이션 노트에 제공된 데이터 결과와 MANTIS® 디스펜서의 HLA 워크플로우를 평가해 주신 Yvonne van Berkel(선임 분석가 Cellulaire Immunologie en Histocompatibiliteit) 및 LMI 팀에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 애플리케이션 노트에 제공된 데이터 결과에 대한 설명. 다른 팀원으로는 Siham Akdimi, Gaby Derksen, Suzanne Hendriks, Jeroen Slager가 있습니다.
출처: @BostonFummerle
시간: 2022.02.21