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La quantification des acides nucléiques est une étape importante des flux de travail en biologie moléculaire, en particulier pour les applications avancées telles que la qPCR et le séquençage de nouvelle génération (NGS). Dans le cadre du NGS, l'objectif ultime est de générer des librairies très complexes et de les séquencer avec un maximum de profondeur et d'homogénéité, d'où l'importance d'une quantification précise. Les deux étapes clés pour déterminer avec précision la concentration d'acide nucléique sont les suivantes :

1. L'efficacité maximale de l'enzyme est sensible à la quantité d'ADN introduite avant la préparation de la librairie et 2) après la préparation de la librairie pour standardiser les échantillons à mettre en commun avant le séquençage. En outre, la nécessité de disposer d'échantillons de plus en plus petits (par exemple, pour les expériences RNA-seq) et la difficulté d'isoler les acides nucléiques à partir de nombreux types d'échantillons courants (par exemple, FFPE et ccfDNA) rendent l'estimation de la concentration difficile.

Bien qu'il existe de nombreuses méthodes de quantification, les systèmes à base de colorants fluorescents sont recommandés pour les applications avancées en aval en raison de leur sensibilité, de leur sélectivité de cible, de leur coût et de leur facilité d'utilisation. Avec le système QuantiFluor® dsDNA, une solution mère de colorant fluorescent est diluée pour former une solution de travail, qui est ajoutée à une plaque de microtitration contenant un petit volume d'échantillon d'ADN purifié, et la fluorescence est mesurée à l'aide d'un fluoromètre. Le système QuantiFluor® dsDNA, sensible et précis, peut être utilisé pour quantifier l'ADNdb dans des tubes individuels ainsi que dans des plaques à 96 et 384 puits.

Garantir la précision lors du pipetage répétitif de petits volumes peut s'avérer difficile et le processus nécessite une main-d'œuvre importante, avec des erreurs et des reprises coûteuses. MANTIS® est un nouveau manipulateur de liquides de paillasse qui répond à de nombreuses exigences en matière de distribution de réactifs à haut débit, pour une fraction du coût des systèmes plus importants. Pour la quantification des acides nucléiques, MANTIS® distribue avec précision de petits volumes de solution de travail de colorant QuantiFluor® pour des résultats quantitatifs reproductibles. Dans cette note d'application, nous démontrons la compatibilité du MANTIS® Liquid Processor pour automatiser rapidement et précisément le traitement des réactifs pour les systèmes QuantiFluor® dsDNA dans les formats de plaques à 96 puits et 384 puits.

Matériel nécessaire

- Instrument MANTIS® (Formulatrix)

- Puce de grande capacité (Formulatrix Cat.# MCHS6)

- Système QuantiFluor® dsDNA (Cat.# E2670)

- Eau exempte de nucléase (Cat.# P1195)

- Plaque noire à fond plat de 96 puits (Corning Cat.# 3915) ou de 384 puits (Corning Cat.# 3573)

- Tubes coniques de 15 ou 50 ml

- Détecteur multi-puits pour la mesure de la fluorescence (par exemple, GloMax Discover System [Cat.# GM3000])

Programme expérimental

Préparation des réactifs. 

1. Préparer le tampon TE 1X : diluer le tampon TE 20X 20 fois avec de l'eau exempte de nucléase.

2. Préparer une solution de travail du colorant QuantiFluor® dsDNA.

   a. Format 96 puits : Diluer le colorant QuantiFluor® dsDNA 1:400 dans un tampon TE 1X. Se reporter au manuel technique du système QuantiFluor® dsDNA #TM346 pour des instructions détaillées sur l'utilisation.

   b. Format 384 puits : Les dilutions de colorant sont basées sur les exigences analytiques souhaitées. (Voir la note d'application pour la quantification de l'ADN à haut débit et à faible volume avec le système QuantiFluor® dsDNA pour des informations sur la manière de sélectionner la dilution de colorant appropriée. ) Ici, nous utilisons une dilution de 1:200 du colorant QuantiFluor® dsDNA dans un tampon TE 1X pour quantifier 0,05-50 ng d'ADN.

3. Préparation de la courbe standard : des dilutions en série ont été effectuées en utilisant une concentration connue d'ADNdb standard et du tampon TE 1X, qui s'étend jusqu'à la gamme de concentration de tout échantillon inconnu. Pour les échantillons vierges, utiliser le tampon TE 1X.

Réglages de l'instrument.

1. Ouvrez l'application de bureau MANTIS® et sélectionnez File > New Distribution List (Fichier > Nouvelle liste de distribution). Sélectionnez votre tableau de mesure dans la liste.
   

2. Le logiciel invite l'utilisateur à ajouter des réactifs à la liste de distribution. Saisir "QuantiFluor dsDNA" dans le champ "Reagent Name" et sélectionner "OK" lorsque vous avez terminé.
   

3. Attribuer QuantiFluor dsDNA à la position #1 de la puce.
   

4. Placer la solution de travail QuantiFluor® dsDNA dans le rack de réactifs à la position #1 de la puce. Placer le tube de la puce dans le réactif.

5. Remplissez la puce et configurez une nouvelle distribution de liquide en sélectionnant le trou souhaité et en entrant le volume cible pour le trou sélectionné.

   a. Format 96 puits : distribuer 200 µl de solution de travail dans chaque puits.

   b. Format 384 puits : distribuer 36 µl de solution de travail dans chaque puits.
   

6. Ajouter la microplaque au plateau MANTIS® et appuyer sur Start.

Détermination analytique :

1. Pipeter manuellement les étalons, les blancs et les échantillons inconnus dans leurs puits respectifs de la plaque multipuits.

   c. Format 96 puits : ajouter 1 à 20 µl d'étalons, de blancs et d'échantillons inconnus.

   d. Format 384 puits : ajouter 4 µl d'étalon, de blanc et d'inconnu.

2. Mélanger soigneusement la microplaque en pipettant le liquide dans chaque puits à l'aide d'un agitateur de plaque ou en pipettant. Si le mélange n'est pas complet, les lectures varieront d'un puits à l'autre. Évitez également d'introduire des bulles d'air, qui peuvent interférer avec la fluorescence.

3. Incuber l'essai pendant 5 minutes à température ambiante.

4. Détecter la fluorescence (504nmEx/531nmEm). En cas d'utilisation d'un instrument de détection GloMax® Systems, sélectionner le protocole préchargé : "QuantiFluor dsDNA System".

5. Calculer la concentration en ADNdb comme suit : retirer la fluorescence de l'échantillon vierge (tampon TE 1X) de la fluorescence de chaque étalon et de l'échantillon. Établir une courbe standard de la fluorescence en fonction de la concentration d'ADN en utilisant les données d'étalonnage des étalons d'ADN. Déterminer la concentration d'ADN de tout échantillon inconnu dans la courbe standard par régression linéaire ou de puissance.

La normalisation.

1. Les valeurs de concentration de l'instrument de détection GloMax® peuvent être importées directement dans le logiciel MANTIS® pour calculer le volume nécessaire à la standardisation (voir figures 1 et 2).

Figure 1 : Quantification de l'étalon d'ADN génomique humain K562 (Cat.# E4931) à l'aide du MANTIS® Liquid Processor pour distribuer les solutions de travail QuantiFluor® dsDNA Dye dans des plaques à 96 puits (Figure A) et des plaques à 384 puits (Figure B). La fluorescence a été mesurée sur le système GloMax® Discover et les échantillons inconnus ont été insérés dans la courbe standard de régression de puissance.

Figure 2 : Quantification du produit PCR de 2 200 pb utilisé pour simuler la taille moyenne des transcrits d'ARNm. Le Mantis Liquid Processor a été utilisé pour distribuer le système QuantiFluor® dsDNA dans des plaques à 96 puits (figure A) et à 384 puits (figure B). La fluorescence a été mesurée sur le système GloMax® Discover et des échantillons inconnus ont été insérés dans la courbe standard de régression de puissance.

résumés

Le processeur de liquide MANTIS® offre aux chercheurs une station de travail flexible pour élaborer une variété de protocoles expérimentaux en quelques minutes. Exécutez ces protocoles avec précision pour améliorer l'efficacité du laboratoire et la reproductibilité des expériences. Cette note d'application démontre la facilité d'utilisation du logiciel de manipulation des liquides, qui permet une transition rapide et transparente vers une plateforme automatisée. L'utilisation de MANTIS® Liquid Handler pour ajouter des réactifs au système QuantiFluor® dsDNA permet une quantification reproductible dans les plaques de microtitration multicouches avec peu ou pas de programmation de l'instrument.

Source : @BostonFummerle

Heure : 2022.02.15