QuantiFluor® dsDNAシステムをMANTIS® Liquid Processorで使用し、高速、高精度、柔軟なDNA定量を行う。
プレゼンテーション
核酸の定量は、分子生物学のワークフロー、特にqPCRや次世代シーケンシング(NGS)のような高度なアプリケーションにおいて重要なステップである。NGSでは、非常に複雑なライブラリーを作製し、最大限の深さと均一性をもって配列決定することが最終目標であるため、正確な定量が特に重要です。核酸濃度を正確に測定するための重要なステップは2つある:
- 酵素効率の最大値は、ライブラリー調製前のDNAインプット量と、2)ライブラリー調製後、シーケンス前にプーリングするサンプルを標準化するためのDNAインプット量に敏感である。さらに、サンプル投入量をますます少なくする必要性(RNA-seq実験など)や、多くの一般的なサンプルタイプ(FFPEやccfDNAなど)から核酸を単離することの難しさが、濃度推定を困難にしている。
複数の定量法が存在する中、蛍光色素ベースのシステムは、その感度、標的選択性、コスト、使いやすさから、高度なダウンストリームアプリケーションに推奨されています。QuantiFluor® dsDNA システムでは、蛍光色素のストック溶液を希釈して作業溶液とし、これを少量の精製 DNA サンプルを含むマイクロタイタープレートに加え、蛍光光度計を用いて蛍光を測定します。高感度で正確なQuantiFluor® dsDNAシステムは、96ウェルや384ウェルプレートだけでなく、シングルチューブ内のdsDNAの定量にも使用できます。
少量の試薬を繰り返しピペッティングする際に正確性を確保することは困難であり、また、このプロセスには多大な労力を要し、エラーやコストのかかる手戻りが発生します。その結果、より高いスループットを必要とするほとんどのラボは、定量分析に自動ロボットリキッドハンドリングプラットフォームを使用することを選択しています。MANTIS®は、ハイスループット試薬分注の多くの要件を満たす新しいベンチトップ型リキッドハンドラーで、大型システムの数分の一のコストです。核酸定量のために、MANTIS®は少量のQuantiFluor®色素作業溶液を正確に分注し、再現性のある定量結果を得ることができます。このアプリケーションノートでは、96ウェルおよび384ウェルプレートフォーマットの両方で、QuantiFluor® dsDNAシステムの試薬処理を迅速かつ正確に自動化するMANTIS® Liquid Processorの適合性を実証します。
必要資料
- MANTIS®装置(Formulatrix社製)
- 大容量チップ(Formulatrix Cat.# MCHS6)
- QuantiFluor® dsDNA システム (Cat.# E2670)
- ヌクレアーゼフリー水 (Cat.# P1195)
- 黒色平底 96 ウェルプレート(Corning Cat.# 3915)または 384 ウェルプレート(Corning Cat.# 3573)
- 15mlまたは50mlコニカル・チューブ
- 蛍光測定用マルチウェル検出器(例:GloMax Discover System [Cat.# GM3000)
実験プログラム
試薬の調製。
1X TE Buffer の調製: 20X TE Buffer をヌクレアーゼを含まない水で 20 倍に希釈する。
QuantiFluor® dsDNA色素の作業溶液を調製する。
a. 96ウェルフォーマット:QuantiFluor® dsDNA色素を1X TEバッファーで1:400に希釈します。使用方法の詳細については、QuantiFluor® dsDNAシステム技術マニュアル#TM346を参照してください。
b. 384ウェルフォーマット:色素希釈は、ご希望の分析要件に基づいて行います。(適切な色素希釈の選択方法については、QuantiFluor® dsDNA システムによるハイスループット、少量 DNA 定量のためのアプリケーションノートを参照してください。 ここでは、0.05-50ng DNAを定量するために、QuantiFluor® dsDNA色素を1X TEバッファーで1:200に希釈したものを使用しています。
標準曲線の調製:既知濃度のdsDNA標準物質と1X TE Bufferを用いて連続希釈を行った。ブランクサンプルには 1X TE Buffer を使用する。
楽器の設定。
MANTIS®デスクトップアプリケーションを開き、ファイル > 新規配布リストを選択します。リストから測定ボードを選択します。
ソフトウェアが試薬を分注リストに追加するよう促します。試薬名」欄に「QuantiFluor dsDNA」と入力し、終了したら「OK」を選択してください。
QuantiFluor dsDNA をマイクロアレイの位置 #1 に割り当てる。
QuantiFluor® dsDNA Working Solutionを試薬ラックのマイクロアレイ位置#1に置きます。チップからチューブを試薬に入れます。
チップに液体を充填し、希望する穴を選択し、選択した穴の目標体積を入力して、新しい液体分注を設定する。
a. 96 ウェルフォーマット:各ウェルに 200μl の作業液を分注します。
b. 384 ウェルフォーマット:36 µl の作業液を各ウェルに分注します。
マイクロプレートをMANTIS®デッキにセットし、Startを押します。
分析決定:
標準品、ブランク、未知検体をマルチウェルプレートの各ウェルに手動でピペッティングします。
c. 96ウェルフォーマット:標準品、ブランク、未知検体を1~20μl加える。
d. 384 ウェルフォーマット:Standard、Blank、Unknown を 4 µl ずつ加える。
プレートシェーカーまたはピペットを使用して各ウェルの液体をピペッティングし、マイクロプレートを十分に混合してください。十分に混合しないと、ウェル間で測定値にばらつきが生じる。また、蛍光を阻害する気泡の混入も避けてください。
アッセイを室温で5分間インキュベートする。
蛍光を検出する(504nmEx/531nmEm)。GloMax® システムの検出装置を使用する場合は、プリロードされたプロトコール「QuantiFluor dsDNA System」を選択する。
dsDNA濃度を以下のように計算する:各標準試料と試料の蛍光からブランク試料(1X TEバッファー)の蛍光を除去する。DNA標準物質の検量線データを用いて、蛍光対DNA濃度の標準曲線を作成する。標準曲線中の未知サンプルの DNA 濃度を線形回帰または累乗回帰により決定する。
標準化。
- GloMax®検出装置からの濃度値は、MANTIS®ソフトウェアに直接インポートして、標準化に必要な容量を計算することができます(図1および2を参照)。
図1. QuantiFluor® dsDNA Dye作業溶液を96ウェルプレート(図A)および384ウェルプレート(図B)に分注するためにMANTIS® Liquid Processorを使用したK562ヒトゲノムDNAスタンダード(Cat.# E4931)の定量。蛍光はGloMax® Discoverシステムで測定し、未知サンプルはパワー回帰標準曲線内から挿入しました。
図2. mRNA転写産物の平均サイズをシミュレートするために使用した2,200bp PCR産物の定量。 Mantis Liquid Processorを使用して、QuantiFluor® dsDNAシステムを96ウェルプレートフォーマット(図A)および384ウェルプレートフォーマット(図B)で分注した。蛍光はGloMax® Discoverシステムで測定し、未知サンプルはパワー回帰標準曲線内から挿入した。
概要
MANTIS® Liquid Processorは、様々な実験プロトコルを数分で構築できる柔軟なワークステーションを研究者に提供します。これらのプロトコルを正確に実行し、研究室の効率と実験の再現性を向上させます。このアプリケーションノートでは、自動化プラットフォームへの迅速かつシームレスな移行を可能にするリキッドハンドリングソフトウェアの使いやすさを紹介します。QuantiFluor® dsDNAシステムに試薬を添加するためにMANTIS®リキッドハンドラーを使用することで、装置のプログラミングをほとんど、あるいは全く行うことなく、多層マイクロタイタープレートで再現性のある定量が可能になります。
出典:@BostonFummerle
時間:2022.02.15