Fast, accurate and flexible DNA quantification using the QuantiFluor® dsDNA System on the MANTIS® Liquid Processor

Introduction

核酸定量是分子生物学工作流程中的一个重要步骤,特别是对于qPCR 和下一代测序 (NGS) 等高级应用而言。在 NGS 中,最终目标是生成高度复杂的文库,并以最大程度的深度和均一性进行测序,因此准确定量尤为重要。准确测定核酸浓度的两个关键步骤是:

  1. 在最大酶效率对 DNA 输入量敏感的文库制备前和 2) 在文库制备后标准化样品以在测序前汇集。此外,对越来越少的样本输入(例如,用于 RNA-seq 实验)的需求以及从许多常见样本类型(如 FFPE 和ccfDNA)中分离核酸的挑战使得浓度估计变得困难。

虽然存在多种定量方法,但基于荧光染料的系统因其灵敏度、目标选择性、成本和易用性而被推荐用于高级下游应用。使用QuantiFluor® dsDNA 系统,荧光染料原液被稀释形成工作溶液,添加到含有少量体积的纯化 DNA 样品的微孔板中,并使用荧光计测量荧光。灵敏且准确的 QuantiFluor® dsDNA 系统可用于定量单管以及96 孔和 384 孔板中的 dsDNA。

要保证小体积重复移液过程中的准确性会是件困难的事,而且过程中劳动密集,会出现失误和代价高昂的返工情况。因此,大多数需要更高通量的实验室选择用自动化机器人液体处理平台来进行定量分析。MANTIS® 是一种新型台式液体处理器,可满足高通量试剂分配的许多要求,而其成本仅为大型系统的一小半。对于核酸定量,MANTIS®可准确分配少量体积的 QuantiFluor® 染料工作溶液,以获得可重现的定量结果。在本应用说明中,我们展示了 MANTIS® 液体处理器的兼容性,它可以快速准确地自动化进行 96 孔和 384 孔板格式的 QuantiFluor® dsDNA 系统的试剂处理。

 

所需材料

• MANTIS® 仪器 (Formulatrix)

• 大容量芯片 (Formulatrix Cat.# MCHS6)

• QuantiFluor® dsDNA 系统 (Cat.# E2670)

• 无核酸酶水 (Cat.# P1195)

• 黑色平底 96 孔板(Corning Cat.# 3915) 或384 孔板(Corning Cat.# 3573)

• 15ml 或 50ml 锥形管

• 可测量荧光的多孔检测仪 (e.g., GloMax Discover System [Cat.# GM3000])

   

实验方案

试剂制备: 

  1. 制备 1X TE 缓冲液: 用无核酸酶水将 20X TE 缓冲液稀释 20 倍。

  2. 制备 QuantiFluor® dsDNA 染料工作溶液。

    a. 96 孔格式:在 1X TE 缓冲液中按 1:400 稀释 QuantiFluor® dsDNA 染料。有关详细使用说明,请参阅QuantiFluor® dsDNA 系统技术手册 #TM346。

    b. 384 孔格式:根据您所需的分析要求进行染料稀释。(请参阅使用 QuantiFluor® dsDNA 系统进行高通量、低体积 DNA 定量应用说明,了解如何选择合适的染料稀释度 。 )这里我们在1X TE 缓冲液中使用 1:200 稀释的 QuantiFluor® dsDNA 染料来定量 0.05–50ng DNA。

  3. 制备标准曲线: 使用已知浓度的 dsDNA 标准品和 1X TE 缓冲液进行连续稀释,该缓冲液在任何未知样品的浓度范围上下延伸。对于空白样品,使用 1X TE 缓冲液。

仪器设置:

  1. 打开 MANTIS® 桌面应用程序并选择“文件”>“新建分配列表”。从列表中选择您的测定板。

  2. 软件将提示用户将试剂添加到分配列表中。在“试剂名称”字段中输入“QuantiFluor dsDNA”,完成后选择“确 定”。

  3. 将 QuantiFluor dsDNA 分配到芯片位置 #1

  4. 将 QuantiFluor® dsDNA 工作溶液置于芯片位置 #1 的试剂架中。将试管从芯片放入试剂中。

  5. 充注芯片并设置新的液体分配,具体做法为选择所需的孔并输入所选孔的目标体积

    a. 96 孔格式:将 200 µl 工作溶液分配到每个孔中。

    b. 384 孔格式:将 36 µl 工作溶液分配到每个孔中。

  6. 将微孔板添加到 MANTIS®deck 并按下启动。

 

分析测定:

  1. 手动将标准品、空白和未知样品移液到多孔板各自的孔中。

    c. 96-孔格式: 添加 1–20 µl 标准品、空白和未知样品。

    d. 384-孔格式: 添加 4µl 标准品、空白和未知样品。

  2. 使用摇板器或通过移液器移液每个孔中的液体将微孔板彻底混合。未能充分混合将导致孔之间的读数变化。还要避免引入气泡,这会干扰荧光。

  3. 在室温下培养测定物5 分钟。

  4. 检测荧光 (504nmEx/531nmEm)。如果使用 GloMax® Systems 检测仪器,请选择预加载的方案:“QuantiFluor dsDNA 系统”。

  5. 计算 dsDNA 浓度如下:从每个标准和样品荧光中去除空白样品(1X TE 缓冲液)的荧光。使用来自DNA 标准的校正数据生成荧光与 DNA 浓度的标准曲线。通过线性回归或幂回归确定标准曲线中任何未知样品的 DNA 浓度。

标准化:

  1. 来自 GloMax® 检测仪器的浓度值可以直接导入 MANTIS® 软件,以计算标准化所需的体积(参见图 1 和图2)。

图 1. 使用 MANTIS® 液体处理器分配 96 孔板(图 A)和 384 孔板(图 B)中的 QuantiFluor® dsDNA 染料工作溶液,对K562 人类基因组 DNA 标准品(Cat.# E4931)进行定量。在 GloMax® Discover System 上测量荧光,并从幂回归标准曲线内插入未知样品。

图 2. 用于模拟 mRNA 转录本平均大小的 2,200bp PCR 产物的定量。 Mantis 液体处理器用于分配 96 孔板形式(图 A)和384 孔板形式(图 B)的 QuantiFluor® dsDNA 系统。在 GloMax® Discover System 上测量荧光,并从幂回归标准曲线内插入未知样品。

 

Summary

MANTIS® 液体处理器为研究人员提供了一个灵活的工作站,可在几分钟内建立各种实验方案。精确执行这些方案以提高实验室效率和实验重现性。本应用说明展示了液体处理软件的易用性,它可快速无缝地过渡到自动化平台。使用 MANTIS® 液体处理器为 QuantiFluor® dsDNA 系统添加试剂可在多层微孔板中实现可重现的定量,几乎无需仪器编程。

 

Source: @BostonFummerle

时间:2022.02.15

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