MANTIS®液体プロセッサーによるオルガノイド培養の拡大:MITのケーススタディ
オルガノイドは、研究者が組織生物学を驚くほど忠実に研究することを可能にする。主要な臓器特異的特徴を表示するために3D in vitro培養系を用いることで、これらの複雑な多細胞構造は、生理学的に適切な洞察をもたらし、多くの研究分野の発展に役立っている。従来のオルガノイド培養の主な限界は、適度なスループットを達成するために高度に専門化した人材を必要とする、労働集約的で手間のかかるプロセスであることが多いことです。FORMULATRIX社のMANTIS® Liquid Processorを使用することで、マサチューセッツ工科大学(MIT)のShalek研究室の研究者は、小腸オルガノイド内のPAN細胞の分化を促進する能力について、投与量を変えながら450以上の低分子を迅速にスクリーニングすることができました。材料は、限られたサンプルにおける複数の変化の理解を進めるために不可欠である。
腸上皮バリアは重要な治療標的である
皮膚、気道、腸管細胞によって形成される組織バリアは、環境との相互作用と環境からの保護を提供する。体液、栄養素、電解質、代謝廃棄物レベルのバランスをとり、免疫系と密接に連携して病原体に対する防御を行い、腫瘍の監視と根絶において重要な役割を果たしている。
組織バリア機能不全は、感染症、がん、アレルギー、様々な自己免疫疾患など、様々な疾患状態と関連している。環境暴露は抗ウイルス薬や抗生物質などの治療で軽減でき、免疫応答はワクチンや免疫療法で修正できるが、既存の方法では解決できない場合もある。
組織バリアの重要な構成要素であるにもかかわらず、腸管上皮バリアはこれまで治療標的として十分に利用されてこなかった。オルガノイド系を用いて、さまざまな起源の腸管上皮バリア組織をモデル化することで、研究者はこの複雑なシステムをより深く理解することができ、さまざまな疾患の治療につながる治療法の開発につなげることができる。
臓器のようなモデルが研究の進歩を牽引
オルガノイドは、近年の幹細胞研究における最も価値ある進歩の一つである。個々の成体幹細胞、成体幹細胞を含む組織サンプル、あるいは多能性幹細胞の分化誘導によって得られたオルガノイドは、臓器特異的な細胞型に分化することができる幹細胞集団を含んでいる。これらの細胞は、その臓器に類似した空間的組織と機能を示し、生体内の状態を模倣した生理学的に適切なシステムを生み出す。
図1. クラス器官は、この小腸クラス器官の陰窩/絨毛の形態のように、代表的な器官と同様の空間的組織と機能を示す。
オルガノイド研究はフラックスによって制限される
オルガノイドの培養には様々な方法がある。線維芽細胞フィーダー層の存在下での幹細胞の培養や、 制御された生体材料マトリックスの表面での培養などがあるが、 最もポピュラーな方法は、マトリゲル(Matrigel®)のような生体由来 の細胞外マトリックス(ECM)に幹細胞を封入する方法である。プレート接種したマトリゲル®ドームに、特定の増殖因子を含む細胞培養培地を封入することで、細胞はその後増殖し、研究者の関心臓器を代表する三次元構造を形成する。
図2. Matrigel®ドームは幹細胞を包み込み、その増殖を促進して生理学的に適切な三次元構造を形成する。
Matrigel® ドーム上へのオルガノイドプレート植え付けに は、3つの特別な要件がある:1)最大限の増殖に必要なドー ム形状を維持するためにウェルの縁を避けながら、予め 加熱した組織培養プレート上に細胞負荷ECMを正確に堆積 させること、2)サンプル材料が非常に限られていることが 多いので、非常に少量で正確に操作すること、3)Matrigel® は4℃の粘性液体であり、硬化したハイドロゲルを形成す るために適度な温度制御が必要である。Matrigel®や類似の基質は4℃では粘性のある液体として存在し、硬化したハイドロゲルを形成するには暖かい表面と環境が必要である。
これらの要件の結果、オルガノイド培養を従来のスクリーニング装置(96/384/1536ウェルフォーマット)に適合するスケールまで小型化することは極めて困難である。面倒で時間のかかるMatrigel®沈着プロセスは、48ウェルプレート上で手作業で行うことができるが、プレート容積が大きくなると液滴の誤形成率が著しく上昇し、実験の再現性が大きく制限される。
MANTIS®は、ミニチュア化されたオルガノイド研究のためのベンチサイズのソリューションです。
手作業によるMatrigel® 培養法の限界を克服するため、MITのShalek研究室の研究者たちは、FORMULATRIXのMANTIS® Liquid Processorを使用して、Matrigel® 液滴をさまざまなプレート形式(最大384ウェル)に分注した。この研究の目的は、ハイスループット法に適したスケールで、小腸オルガノイド系を用いた化合物スクリーニング活動を完了することであった。
MANTIS®は、シングルチャンネルの非接触マイクロ流体ディスペンサーを使用し、個々のウェルに試薬を一度に供給することで、クロスコンタミネーションを防止し、洗浄の必要性をなくすため、液体を使い捨てチップに閉じ込めます。3%未満という業界をリードするCVは、0.1μLまでの正確な分注をサポートする一方で、6~48チップに対応し、25cP(室温でグリセロールの~60%に相当)までの水溶液に対応することで、複数のワークフローに柔軟に対応します。
これらの特徴に加え、MANTISは設置面積がわずか1ft3と小さいため、冷蔵庫やインキュベーターのような温度管理された環境にも簡単に設置できる。また、さまざまなラボ用ソフトウェアや機器と互換性があるため、既存のワークフローにシームレスに統合することができます。
図3 MANTIS®は設置面積が非常に小さく、温度制御された環境に密閉できる。この試験中、MANTIS®を冷蔵庫に入れることで、4℃の加熱面にMatrigel®プレートを接種することができた(灰色=冷たい、赤=温かい)。これはMatrigel®ドームの形成に理想的な条件である。
小腸オルガノイド培養の小型化により重要な知見が得られる
マサチューセッツ工科大学(MIT)シャレック研究所の博士研究員ベン・ミード(Ben Mead)らは、MANTIS®を用いて既存のワークフローを小型化し、小腸オルガノイド系で化合物ライブラリーをスクリーニングして、PAN細胞の分化を促進する可能性のある機器分子を同定した。PAN細胞は、ヒト小腸の主要な抗微生物産生細胞であり、上皮バリア機能に重要である。
ロバストな統計的測定データ(未発表)を適用した結果、Meadたちは多くの苗木化合物を同定した。これらのいくつかは追跡研究に移行しており、PAN細胞の標的分化において考慮すべき新たな生物学的標的を描き出す重要な機会を提供している。
規模拡大が個別化医療の機会を増やす
MANTIS®のいくつかの重要な特徴が、MITの研究者たちの発見の基礎となっている。MANTIS®は、Matrigel®液滴を吐出するために1本のフリーアームを使用することで、様々なプレート形式(最大384ウェル)で正確なプレート接種を可能にし、実験規模を拡大する。この装置は1536ウェルプレートにも対応し、必要に応じてスループットをさらに拡大することができる。
洗浄可能な使い捨てチップ付きピペットチップにより、MITの研究者は試薬の必要量と関連コストを削減しながら、限られたサンプル量を扱うことができる。さらに、MANTIS®は設置面積が小さいので、ユニット全体を標準的な冷蔵庫に簡単に設置でき、予熱ブロックと組み合わせて、あらかじめ温めた組織培養表面に冷却したマトリゲル®液滴を正確に付着させることができる(図4参照)。
図4 MANTIS®は、ウェルあたりのMatrigel®の量、プレートの接種培地の量、接種する腸管オルガノイドの数など、必要な試薬を大幅に削減し、プレートの接種時間も短縮する。
マサチューセッツ工科大学(MIT)の研究者たちは、MANTIS®が提供する小型化アプローチが、有限材料の複数のバリエーションを研究するのに有効であることを実証した。これは、一人の患者の生検からオルガノイドを検出することに関連し、個別化医療に多くの新しい機会を開くものである。MANTIS®は、大規模化の必要性を実現する鍵である。
出典:@BostonFummerle
時間:2022.01.11