представить (кого-л. на работу и т.д.)

Количественное определение нуклеиновых кислот - важный этап в рабочих процессах молекулярной биологии, особенно в таких передовых приложениях, как qPCR и секвенирование следующего поколения (NGS). В NGS конечной целью является создание библиотек высокой сложности и их последовательность с максимальной глубиной и однородностью, поэтому точное количественное определение особенно важно. Для точного определения концентрации нуклеиновых кислот необходимо выполнить два ключевых шага:

1. Максимальная эффективность фермента зависит от количества ДНК, вносимой до подготовки библиотеки и 2) после подготовки библиотеки для стандартизации образцов для объединения перед секвенированием. Кроме того, необходимость использования все более мелких образцов (например, для экспериментов с РНК-секвенированием) и сложность выделения нуклеиновых кислот из многих распространенных типов образцов (например, FFPE и ccfDNA) затрудняют оценку концентрации.

Несмотря на существование множества методов количественного определения, системы на основе флуоресцентных красителей рекомендуются для передовых последующих приложений благодаря их чувствительности, селективности по отношению к мишеням, стоимости и простоте использования. В системе QuantiFluor® dsDNA System исходный раствор флуоресцентного красителя разбавляют до получения рабочего раствора, который добавляют в микротитровальный планшет, содержащий небольшой объем очищенного образца ДНК, и измеряют флуоресценцию с помощью флуорометра. Чувствительная и точная система QuantiFluor® dsDNA System может использоваться для количественного определения дсДНК в отдельных пробирках, а также в 96- и 384-луночных планшетах.

Обеспечение точности при многократном дозировании небольших объемов может быть затруднено, а сам процесс является трудоемким, чреват ошибками и дорогостоящей доработкой. В результате большинство лабораторий, которым требуется большая производительность, предпочитают использовать автоматизированные роботизированные платформы для обработки жидкостей для количественного анализа. MANTIS® - это новый настольный обработчик жидкостей, который отвечает многим требованиям к высокопроизводительному дозированию реагентов при меньшей стоимости больших систем. Для количественного определения нуклеиновых кислот MANTIS® точно дозирует небольшие объемы рабочего раствора красителя QuantiFluor® для получения воспроизводимых количественных результатов. В этом приложении мы демонстрируем совместимость MANTIS® Liquid Processor для быстрой и точной автоматизации обработки реагентов для систем QuantiFluor® dsDNA в форматах 96- и 384-луночных планшетов.

Необходимые материалы

- Прибор MANTIS® (Formulatrix)

- Чип высокой емкости (Formulatrix Cat.# MCHS6)

- Система QuantiFluor® dsDNA (кат.# E2670)

- Вода, не содержащая нуклеазы (кат.# P1195)

- Черный плоскодонный 96-луночный планшет (Corning Cat.# 3915) или 384-луночный планшет (Corning Cat.# 3573)

- Конические пробирки на 15 или 50 мл

- Многолуночный детектор для измерения флуоресценции (например, GloMax Discover System [Cat.# GM3000])

Экспериментальная программа

Подготовка реагентов. 

1. Приготовьте 1X TE Buffer: разбавьте 20X TE Buffer в 20 раз водой, не содержащей нуклеазы.

2. Приготовьте рабочий раствор красителя QuantiFluor® dsDNA.

   a. Формат 96 лунок: Разведите краситель QuantiFluor® dsDNA 1:400 в 1X TE-буфере. Подробные инструкции по использованию см. в техническом руководстве по системе QuantiFluor® dsDNA #TM346.

   b. Формат 384 лунки: разведение красителя зависит от желаемых аналитических требований. (Информацию о том, как выбрать подходящее разведение красителя, см. в Application Note for High-Throughput, Low-Volume DNA QuantiFluor® dsDNA System). ) Здесь мы используем разведение красителя QuantiFluor® dsDNA 1:200 в 1X TE-буфере для количественного определения 0,05-50ng ДНК.

3. Приготовление стандартной кривой: Серийные разведения были сделаны с использованием известной концентрации стандарта дсДНК и 1X TE Buffer, который расширяет диапазон концентраций неизвестного образца вверх и вниз. Для холостых образцов используйте 1X TE Buffer.

Настройки прибора.

1. Откройте настольное приложение MANTIS® и выберите Файл > Новый список рассылки. Выберите свою измерительную плату из списка.
   

2. Программное обеспечение предложит пользователю добавить реагенты в список дозирования. Введите "QuantiFluor dsDNA" в поле "Название реагента" и выберите "OK" после завершения.
   

3. Назначьте QuantiFluor dsDNA на позицию #1 микрочипа.
   

4. Поместите рабочий раствор QuantiFluor® dsDNA в стойку для реагентов в позицию микрочипа #1. Поместите пробирку с чипом в реагент.

5. Заполните чип и настройте новую дозировку жидкости, выбрав нужное отверстие и введя целевой объем для выбранного отверстия

   a. Формат 96 лунок: дозируйте по 200 мкл рабочего раствора в каждую лунку.

   b. Формат 384 лунки: дозируйте 36 мкл рабочего раствора в каждую лунку.
   

6. Установите микропланшет на MANTIS®deck и нажмите Start.

Аналитическое определение:

1. Вручную дозируйте стандарты, холостые и неизвестные образцы в соответствующие лунки многолуночного планшета.

   c. Формат 96 лунок: добавьте 1-20 мкл стандартов, холостых и неизвестных образцов.

   d. Формат 384 лунки: добавьте по 4 мкл стандартного, холостого и неизвестного образцов.

2. Тщательно перемешайте микропланшет, дозируя жидкость в каждую лунку с помощью встряхивателя планшетов или пипеткой. Отсутствие тщательного перемешивания приведет к расхождениям в показаниях между лунками. Также избегайте попадания пузырьков воздуха, которые могут помешать флуоресценции.

3. Инкубируйте анализ в течение 5 минут при комнатной температуре.

4. Определите флуоресценцию (504 нмEx/531 нмEm). При использовании прибора для детекции GloMax® Systems выберите предварительно загруженный протокол: "QuantiFluor dsDNA System".

5. Рассчитайте концентрацию дсДНК следующим образом: отнимите флуоресценцию холостого образца (1X TE-буфер) от флуоресценции каждого стандарта и образца. Постройте стандартную кривую зависимости флуоресценции от концентрации ДНК, используя данные калибровки стандартов ДНК. Определите концентрацию ДНК неизвестных образцов в стандартной кривой с помощью линейной или степенной регрессии.

Стандартизация.

1. Значения концентрации, полученные с помощью прибора для определения GloMax®, могут быть импортированы непосредственно в программное обеспечение MANTIS® для расчета объема, необходимого для стандартизации (см. рис. 1 и 2).

Рисунок 1. Количественное определение стандарта геномной ДНК человека K562 (кат. # E4931) с помощью MANTIS® Liquid Processor для дозирования рабочих растворов красителя QuantiFluor® dsDNA в 96-луночных (рис. A) и 384-луночных (рис. B) планшетах. Флуоресценция измерялась на приборе GloMax® Discover System, а неизвестные образцы вносились в стандартную кривую регрессии мощности.

Рисунок 2. Количественное определение продукта ПЦР длиной 2 200 п.н., используемого для моделирования среднего размера транскриптов мРНК. Для дозирования системы QuantiFluor® dsDNA в 96-луночный (рис. A) и 384-луночный (рис. B) форматы использовался Mantis Liquid Processor. Флуоресценция измерялась на приборе GloMax® Discover System, а неизвестные образцы вносились в стандартную кривую регрессии мощности.

резюме

Жидкостный процессор MANTIS® предоставляет исследователям гибкую рабочую станцию для создания различных экспериментальных протоколов за считанные минуты. Точное выполнение этих протоколов повышает эффективность работы лаборатории и воспроизводимость экспериментов. В этом приложении демонстрируется простота использования программного обеспечения для обработки жидкостей, что позволяет быстро и без проблем перейти на автоматизированную платформу. Использование MANTIS® Liquid Handler для добавления реагентов в систему QuantiFluor® dsDNA System обеспечивает воспроизводимое количественное определение в многослойных микротитровальных планшетах при минимальном программировании прибора или вообще без него.

Источник: @BostonFummerle

Время: 2022.02.15