Quelques questions clés concernant les tests de durée de vie de la fluorescence

Jin Shengye, Institut de physique chimique de Dalian, Académie chinoise des sciences

La détection de la durée de vie de la fluorescence est l'une des techniques couramment utilisées pour évaluer la durée de vie de l'état excité de la matière et les processus cinétiques des porteurs. La sélection et l'utilisation correctes de la technologie de détection de la durée de vie de la fluorescence ainsi que la collecte et l'analyse correctes de la cinétique de la durée de vie de la fluorescence sont particulièrement importantes pour juger des propriétés de l'état excité de la matière, des propriétés des matériaux et des processus cinétiques des porteurs. Au cours des recherches scientifiques passées, nous avons souvent constaté que les paramètres techniques et l'analyse cinétique de l'équipement de détection de la durée de vie de la fluorescence étaient entachés de malentendus et d'idées fausses, ce qui conduit à une évaluation erronée des propriétés cinétiques des porteurs dans les matériaux étudiés. C'est pourquoi nous aimerions présenter brièvement la signification physique de certains paramètres techniques importants de l'équipement de fluorescence et la compréhension des processus cinétiques dans ce court article.

01Principes de base de la durée de vie de la fluorescence

La fluorescence est le processus par lequel un matériau émettant de la lumière absorbe un photon d'excitation et subit ensuite un saut électronique dans les orbitales du niveau d'énergie, ce qui entraîne l'émission de photons à partir des espèces de l'état excité (par exemple, excitons, charges libres, etc.) au moyen de la composition radiative. La fluorescence reflète le processus de passage d'un matériau de l'état fondamental à un état excité, puis sa décroissance jusqu'à l'état fondamental, et sa durée de vie de fluorescence reflète la durée de vie de l'état excité du matériau. La durée de vie de la fluorescence reflète la durée de vie de l'état excité du matériau. Nous utilisons la molécule C comme exemple pour illustrer ce processus :

La molécule C à l'état fondamental absorbe un photon d'excitation et passe à l'état excité C*, et l'état excité Cpeut revenir à l'état fondamental par radioluminescence (kr) ou non radioluminescence (knr). Selon l'équation de vitesse de réaction du premier ordre, à l'instant t après l'excitation, CLe taux de décroissance est de :

L'intégration dans le temps donne la concentration de C* à l'instant t comme suit :

où C0* est la concentration totale des états excités à l'instant t = 0 (c'est-à-dire la concentration totale des états excités produits par l'excitation), et k0= kr + knr.

Dans les expériences de détection de la durée de vie de la fluorescence, le détecteur détecte l'intensité de la luminescence par unité de temps, c'est-à-dire le taux de luminescence de l'échantillon, d(photon)/dt, donc :

Dans les processus de détection réels (par exemple, en utilisant le comptage de photons uniques corrélés dans le temps (TCSPC)), en raison des limites de la précision temporelle du dispositif, le détecteur détermine en fait le taux de luminescence en collectant le nombre de photons (ΔP) sur une petite période de temps (temps bin, Δt), lorsque Δt est suffisamment petit :

où A0 = krC*0. La courbe de durée de vie de la fluorescence recueillie expérimentalement est illustrée à la figure 1.

Figure 1 : Schéma d'une courbe typique de durée de vie de la fluorescence

L'ensemble de la courbe de durée de vie de la fluorescence est composé de valeurs ΔP à des intervalles Δt (bin time) successifs, principalement constitués d'un bord ascendant (formation de l'état excité) et d'un bord descendant (désintégration de l'état excité). La formation de l'état excité est générée par une excitation optique, et la vitesse du front montant est déterminée par le mécanisme de formation de l'état excité (par exemple, excitation directe ou transfert d'énergie, etc. La fonction de réponse de l'instrument détermine la résolution temporelle de la détection de la durée de vie de la fluorescence, qui sera expliquée plus loin. La partie de la décroissance de la durée de vie de la fluorescence peut être exprimée par l'équation (4). En ajustant la courbe de décroissance de manière exponentielle, la constante de vitesse de décroissance de la fluorescence k0 ou la durée de vie de la fluorescence τ0=1/k0 peut être obtenue pour l'échantillon.** On peut constater que la durée de vie de la fluorescence τ0 obtenue dans la détection de la durée de vie de la fluorescence est la somme des constantes de vitesse de tous les canaux de décroissance dans l'état excité (à la fois radiatif et non radiatif), au lieu de la constante de vitesse du seul complexe radiatif.Dans l'ajustement de la courbe de décroissance, A0 est également la valeur Δp (nombre de photons) mesurée en laboratoire à l'instant t=0. L'équation (4) permet de conclure que A0 devrait être A0 = krC0 (L'efficacité de détection des photons du détecteur n'est pas prise en compte ici). Pour les échantillons testés sélectionnés, kr (taux de recombinaison radiative) peut être considéré comme une constante dans des conditions stables, de sorte que A0 dans la courbe de décroissance peut être considéré comme proportionnel à C0, c'est-à-dire la concentration totale d'états excités dans l'échantillon caractérisé par la constante de décroissance k0.

Dans l'illustration schématique ci-dessus, nous utilisons l'équation de décroissance mono-exponentielle comme exemple. Cependant, dans la pratique, la plupart des échantillons présentent des processus de décroissance exponentielle double, voire triple. Personnellement, je pense que l'existence de processus de décroissance multi-exponentielle est due à la nature inhomogène de l'échantillon à la fois sur le plan spatial et temporel. L'inhomogénéité spatiale signifie que les nombreux individus luminescents (par exemple, des molécules individuelles ou des nanoparticules individuelles) contenus dans un échantillon macroscopique sont différents les uns des autres (les individus eux-mêmes ou leur environnement microscopique). Pour un seul individu luminescent dans un échantillon, son microenvironnement peut être très différent, comme une distribution inégale des états de défaut, une température inégale, une distribution inégale des interfaces de surface, etc., ce qui fait que le k0 des individus luminescents dans l'échantillon n'est pas exactement le même, mais qu'il y a plutôt une distribution telle que les courbes de durée de vie de la fluorescence des échantillons macroscopiques se reflètent comme un processus de décroissance multiexponentielle dont la moyenne est calculée sur de nombreux individus. En outre, au cours de l'acquisition de la durée de vie de fluorescence des échantillons, la fluctuation des conditions environnementales ou l'apparition de certains processus physiques peuvent également faire en sorte que les échantillons présentent des durées de vie de fluorescence différentes à différents moments d'acquisition, ce qui fait que les courbes finales de durée de vie de fluorescence se manifestent sous la forme d'un processus multiexponentiel. En ajustant l'équation multi-exponentielle de l'Eq. (5), nous pouvons dériver les valeurs de durée de vie de fluorescence des différentes composantes de la durée de vie de fluorescence (k1, k2 ...) et les contributions de chaque composante dans la courbe de durée de vie globale (A1, A2 ...) :

En outre, la description ci-dessus est en termes de réaction primaire (exponentielle e), traitant l'espèce de l'état excité comme un tout (par exemple, un état de ligne unique ou un exciton). Si la luminescence est produite par un complexe d'électrons et de trous libres, sa courbe de décroissance de la durée de vie de la fluorescence doit être exprimée en termes de réaction secondaire (exposant de puissance), c'est-à-dire :

Le processus cinétique est plus complexe, veuillez vous référer à la littérature correspondante pour des études connexes, et ne sera pas répété ici.

02Principes techniques de la détection de la durée de vie par fluorescence

Le comptage des photons uniques corrélés au temps (TCSPC) est la méthode d'essai de durée de vie de fluorescence la plus utilisée aujourd'hui. Tout d'abord, il convient de préciser que la courbe de durée de vie de la fluorescence est le résultat du comptage d'un grand nombre de photons. En supposant qu'un échantillon macroscopique (en vrac) produise 1000 états excités en une seule excitation, une courbe de durée de vie de la fluorescence peut être obtenue si un détecteur enregistre l'intensité de ces 1000 états excités à différents délais après l'excitation. De même, si le détecteur (par exemple, un détecteur à photon unique) n'enregistre qu'un seul photon lors d'une excitation et répète l'excitation 1000 fois, la courbe de durée de vie de la fluorescence de l'échantillon peut également être obtenue.La TCSPC est basée sur le concept de la statistique du photon unique.L'équipement de détection de la durée de vie de la fluorescence de la TCSPC se compose principalement de lasers pulsés, de détecteurs de photons à haute sensibilité et de cartes TCSPC, et le principe de sa détection peut être illustré à la figure 2. L'impulsion laser excite l'échantillon pour produire un état excité, suivi par l'émission composée de photons de fluorescence au temps t1, qui sont recueillis par le détecteur. Le temps t1 est la différence de temps entre le signal de l'impulsion laser et le signal de fluorescence enregistré par le TCSPC à cette excitation (microtemps). Cependant, dans la détection TCSPC, toutes les impulsions laser ne peuvent pas produire les photons fluorescents capturés (limités par des facteurs tels que l'efficacité quantique de fluorescence de l'échantillon et l'efficacité d'acquisition du dispositif, par exemple, le nombre de photons par unité de temps (comptes/s) enregistrés par le détecteur est généralement inférieur de 1 à 2 ordres de grandeur à la re-fréquence du laser), et donc afin de n'enregistrer que les micro-temps auxquels les photons fluorescents sont produits (ce qui économise beaucoup de mémoire), la carte TCSPC enregistre les micro-temps auxquels les photons fluorescents sont produits. La carte TCSPC enregistre la différence de temps entre le signal de fluorescence et le signal de l'impulsion laser suivante qui lui est adjacente (t1′ dans la figure 2), puis, sur la base de la période de temps de l'impulsion laser T (qui est une valeur fixe sous la nouvelle fréquence laser sélectionnée), nous pouvons obtenir t1 = T - t'1. Les micro-temps du grand nombre de photons collectés (t1, t2, ...) peuvent être utilisés comme base pour l'équation suivante. t3 ...) d'un grand nombre de photons collectés sont comptés statistiquement pour obtenir une courbe de durée de vie de la fluorescence.

Figure 2 : Principe de la détection de la durée de vie de la fluorescence par le TCSPC

a : principe d'enregistrement du temps de la carte TCSPC ; b : comptage statistique du temps des photons individuels pour construire la courbe de durée de vie de la fluorescence ; c : diagramme schématique de la structure de l'instrument de détection de la fluorescence TCSPC.

Le comptage micro-temporel des photons fluorescents dans la courbe de durée de vie du TCSPC est basé sur le nombre de canaux. Si la fenêtre temporelle d'acquisition est fixée à 100 ns et que le nombre de canaux est de 4096, l'intervalle de temps dans la courbe de durée de vie de la fluorescence est de 100 ns/4096 = 24,4 ps, qui est le temps bin (∆t) dans les figures 1 et 2, et les points d'enregistrement du temps de l'axe temporel dans la courbe de durée de vie de la fluorescence sont 0, 24,4, 48,8, 73,2 ----. La microchronologie de chaque photon, complète le comptage du nombre de photons dans chaque intervalle ∆t pour construire la courbe de durée de vie de la fluorescence. Basée sur le principe d'acquisition de la TCSPC, cette méthode peut généralement avoir une résolution temporelle élevée et est plus adaptée à une utilisation dans des conditions de haute fréquence laser. Lorsque la fréquence du laser est faible (par exemple < 1 KHz), l'efficacité de l'acquisition de la durée de vie de la fluorescence sera faible (moins de photons par unité de temps).Il est particulièrement important de noter que ce ∆t (bin time) ne correspond pas à la résolution temporelle de la sonde de durée de vie de la fluorescence, mais représente uniquement la précision temporelle de la carte TCSPC !

En outre, il existe également un concept de macrotemps dans la détection TCSPC, qui est l'enregistrement du temps d'un photon fluorescent par rapport au moment du début de l'acquisition expérimentale, et qui est fondamentalement différent des microtemps des photons dans les durées de vie de la fluorescence.

La structure de base de l'instrument de détection de fluorescence TCSPC construit sur la base du principe susmentionné peut être illustrée à la figure 2c, qui comprend principalement des composants essentiels tels que des lasers, des détecteurs et des cartes TCSPC. Le laser et le détecteur émettent des signaux électriques synchronisés lorsqu'ils émettent de la lumière laser et détectent des photons, qui sont détectés par la carte TCSPC, et le microtemps et le macrotemps de chaque photon de fluorescence sont acquis et calculés pour construire statistiquement la courbe de durée de vie de la fluorescence.

Lors de l'acquisition de la durée de vie de la fluorescence, on constate souvent que la courbe de la durée de vie de la fluorescence ne commence pas à l'instant 0 de la fenêtre temporelle, mais qu'il y a un retard Td (comme le montre la figure 3). Dans la détection de la durée de vie de la fluorescence, la carte TCSPC acquiert la microchronisation des photons en enregistrant les signaux électriques de sortie synchronisés du laser et du détecteur, tandis que le temps de réponse de l'équipement électronique et le temps de transmission des signaux électriques dans la ligne entraînent une différence de temps inhérente entre les signaux électriques synchronisés et les signaux optiques réels, ce qui se traduit par un retard dans la fenêtre temporelle de la durée de vie de la fluorescence. Ce retard n'affecte pas l'acquisition de la durée de vie de la fluorescence, mais réduit l'utilisation de la fenêtre temporelle. L'ampleur du retard peut être ajustée en modifiant la longueur de la ligne de transmission du signal électrique ou en réglant le paramètre de retard du signal électrique.

Figure 3 : Phénomène de retard dans l'acquisition de la durée de vie de la fluorescence et ses causes.

En plus de la technique TCSPC, la durée de vie de la fluorescence peut également être acquise à l'aide d'un oscilloscope. Contrairement à la TCSPC, qui n'enregistre au maximum qu'un temps de photon pour une impulsion d'excitation, les oscilloscopes peuvent réaliser une acquisition continue à grande vitesse de l'intensité de fluorescence après une impulsion d'excitation afin d'obtenir des courbes de durée de vie de la fluorescence, et la précision du balayage temporel est déterminée par la largeur de bande de l'oscilloscope (et non par la fréquence d'échantillonnage). Par exemple, un oscilloscope d'une largeur de bande de 500M peut réaliser un balayage temporel avec une précision de 2ns, ce qui est bien inférieur à celle de la TCSPC, alors que les oscilloscopes avec des largeurs de bande plus élevées (par exemple, au-dessus de GHz) sont très coûteux. Par conséquent, en raison de la limitation de la largeur de bande, la méthode de l'oscilloscope est surtout adaptée aux échantillons à durée de vie de fluorescence plus longue (par exemple, la phosphorescence) et à la détection dans des conditions de fréquence de réapparition du laser plus faibles.

03Paramètres fondamentaux de la détection de la durée de vie de la fluorescence

Pour obtenir une acquisition et une analyse précises des durées de vie de la fluorescence, il faut d'abord définir un certain nombre de paramètres fondamentaux de la détection de la fluorescence, notamment la résolution temporelle, la plage de fenêtres temporelles et la précision temporelle.

1) Résolution temporelle et fonction de réponse de l'instrument (IRF)

La résolution temporelle est le paramètre le plus important de la technologie de détection de la durée de vie de la fluorescence, qui est déterminée par la fonction de réponse globale de l'instrument (IRF) du système de détection (y compris le laser, le détecteur et la carte TCSPC). ** L'instrument utilisé dans le laser, le détecteur et la carte TCSPC et d'autres composants électroniques existent dans le signal optique en un temps de réponse du signal électrique (temps de réponse) et une gigue temporelle du signal électrique (gigue), en plus du laser existe également dans la largeur d'impulsion du laser (largeur d'impulsion) du problème, les facteurs ci-dessus déterminent la taille de l'IRF. Détection de fluorescence par TCSPC Dans la détection de fluorescence par TCSPC, la précision temporelle des cartes TCSPC peut atteindre <10 ps, ce qui est généralement beaucoup plus élevé que celle des lasers et des détecteurs. Par conséquent, l'IRF d'un système de détection de fluorescence TCSPC provient principalement des lasers et des détecteurs.

Du côté du laser, les facteurs contribuant à la FRI comprennent principalement la largeur d'impulsion du laser et la gigue des signaux électriques synchronisés, comme le montre la figure 4. La largeur d'impulsion du laser est l'un des paramètres les plus importants d'un laser pulsé et est exprimée par la valeur FWHM (full width half maximum) de l'élargissement de l'impulsion dans le temps (Fig. 4). En outre, la carte TCSPC acquiert la re-fréquence du laser et le temps de cycle T en collectant le signal de synchronisation des impulsions du laser (SYNC), qui introduit une gigue temporelle entre chaque signal d'impulsion, c'est-à-dire que la période d'impulsion dans le signal n'est pas un temps T précis, mais un temps T + gigue temporelle. Selon le calcul de la microchronisation des photons fluorescents (t1, t2 dans la figure 2) t1 = T - t'1, la gigue au temps T (même si elle est beaucoup plus petite que T) se reporte sur le temps t1 et contribue ainsi à la fonction correspondante de l'instrument.

Figure 4 : Contribution du laser à la FRI, principalement due à la largeur d'impulsion du laser et à la gigue temporelle (gigue) dans les signaux électriques synchronisés.

Actuellement, la largeur d'impulsion des lasers utilisés dans la détection TCSPC peut être choisie entre fs, ps et ns. La gigue des signaux électriques synchronisés est généralement de l'ordre d'une centaine de ps. Lorsque la largeur d'impulsion du laser est beaucoup plus grande que la gigue (par exemple, laser ns), la contribution de la FRI provient principalement de la largeur d'impulsion, et lorsque le temps de gigue est beaucoup plus grand que la largeur d'impulsion du laser (par exemple, laser fs), la contribution de la FRI provient principalement de la gigue, et lorsqu'ils sont proches l'un de l'autre (par exemple, laser ps), la contribution de la FRI est l'effet commun.

Du côté du détecteur, il existe également des problèmes de temps de réponse du détecteur et de gigue temporelle du signal électrique similaires à ceux décrits ci-dessus (comme le montre la figure 5). Lorsque le détecteur détecte un photon, il émet un signal d'impulsion électrique correspondant, dont le front ascendant représente le temps de réponse du détecteur (temps transitoire) ; dans la détection TCSPC, un seuil de signal (TH) est fixé pour filtrer les signaux d'impulsion électrique valides, et un discriminateur à fraction constante enregistre avec précision le temps d'arrivée du photon au détecteur sans être affecté par les fluctuations d'intensité. Un discriminateur à fraction constante est utilisé pour enregistrer avec précision le temps d'arrivée des photons au détecteur, indépendamment des fluctuations d'intensité. Le temps de transit du détecteur lui-même ne contribue pas en principe à la FRI de l'instrument. Cependant, lors de la détection répétée de photons, pour les photons qui arrivent au détecteur même au même moment, il y a une distribution temporelle et une déviation de leurs signaux électriques de sortie les uns par rapport aux autres, c'est-à-dire l'étalement du temps de transit (voir figure 5), qui crée la gigue du détecteur et contribue ainsi à la fluctuation globale de l'intensité. La gigue du détecteur contribue à l'IRF de l'ensemble du système.

Fig. 5 : Contribution de la gigue temporelle du détecteur à l'IRF. Le détecteur détecte un photon et génère un signal de télécommunication pulsé, et le moment où le photon atteint la détection est déterminé par un seuil de télécommunication défini. En raison de la présence du temps de transition qui se déroule, la gigue temporelle (gigue) du signal électrique de télécommunication est causée par

Actuellement, les détecteurs tels que les détecteurs à photon unique et les PMT sont principalement utilisés dans les instruments commerciaux, où la gigue de la plupart des détecteurs à photon unique peut généralement atteindre moins de 100 ps, tandis que les détecteurs PMT conventionnels peuvent atteindre une gigue de 1 à 2 ns, et les PMT spéciaux à plaque à microcanaux (MCP) ou les PMT hybrides peuvent atteindre moins de 100 ps. Par conséquent, l'auteur estime que si le système utilise des détecteurs PMT conventionnels, il ne conviendra que pour la détection d'échantillons à durée de vie de fluorescence plus longue.

Il s'ensuit que l'IRF global d'un système de durée de vie de fluorescence se compose d'un laser et d'un détecteur, dont la valeur peut être déterminée par l'équation théorique suivante :

Dans l'expérience, l'IRF du système de détection de fluorescence utilisé peut être obtenu en sondant directement le signal diffusé du laser, comme le montre la figure 6.La valeur de l'IRF peut être définie comme la valeur FWHM de la courbe IRF mesurée.Une valeur IRF plus petite représente une résolution temporelle plus élevée de l'instrument.

Figure 6 : IRF pour les systèmes de détection de la durée de vie de la fluorescence

Par conséquent, les courbes de durée de vie de la fluorescence mesurées dans nos expériences sont le résultat de la convolution de l'IRF avec le signal de fluorescence (Fig. 7a). **Comme l'IRF détermine directement la résolution temporelle de la détection de la durée de vie de la fluorescence, sa taille a un impact considérable sur les résultats de l'acquisition de la durée de vie de la fluorescence et sur l'analyse. ** Avant l'opération expérimentale, il convient de déterminer si la taille de l'IRF du dispositif est adaptée à la mesure de la durée de vie de la fluorescence de l'échantillon à détecter. Comme le montre la figure 7b, pour le test du même échantillon, le résultat du test d'un dispositif doté d'un petit IRF présentera un processus de front de montée plus rapide et plus net, tandis que le résultat du test d'un dispositif doté d'un IRF plus grand présentera un processus de front de montée plus lent et plus doux. Si le processus de désintégration de la durée de vie de la fluorescence contient une composante de désintégration rapide, seul un dispositif doté d'un petit IRF peut être en mesure de capturer efficacement la composante rapide (IRF inférieur à la durée de vie de la composante rapide), alors qu'un dispositif doté d'un grand IRF, en raison de la limitation de la résolution temporelle, ne sera probablement pas en mesure de détecter la présence de la composante de désintégration rapide (par exemple, un IRF beaucoup plus grand que la durée de vie de la composante de désintégration rapide), ce qui entraînera une énorme analyse des résultats de la détection Cela entraînera un énorme biais dans l'analyse des résultats. Par exemple, la durée de vie de la fluorescence est souvent utilisée pour déterminer la concentration d'états défectueux dans un échantillon. Une forte concentration d'états défectueux dans un échantillon entraînera une décroissance rapide de la durée de vie de la fluorescence, et si l'acquisition de la fluorescence est effectuée avec un dispositif qui a un grand IRF, il y a une forte probabilité que la détection de l'éventuel processus de décroissance rapide ne soit pas réalisée, ce qui entraînera une détermination incorrecte de la concentration d'états défectueux dans l'échantillon. En outre, des processus tels que le transfert de charge et le transfert d'énergie dans l'échantillon, ainsi que certaines molécules et certains matériaux semi-conducteurs produisent ou ont des processus de décroissance rapide de la fluorescence, et les études de la dynamique de fluorescence de ces processus et matériaux doivent également être réalisées avec un équipement de détection de la durée de vie de la fluorescence doté d'un IRF plus petit.

Figure 7. a) La courbe de durée de vie de la fluorescence mesurée dans l'expérience est le résultat de la convolution (convolution) de l'IRF avec le signal de fluorescence. b) L'effet de la taille de l'IRF sur la courbe de durée de vie de la fluorescence. Un dispositif doté d'un grand IRF est limité par la résolution temporelle et peut ne pas être en mesure de détecter la composante rapide dans la décroissance de la durée de vie de la fluorescence. c) L'effet de l'IRF sur la courbe de durée de vie de la fluorescence. d) L'effet de l'IRF sur la courbe de durée de vie de la fluorescence. e) L'effet de l'IRF sur le profil de la durée de vie de la fluorescence.

Pour les échantillons dont les durées de vie de fluorescence sont inférieures à l'IRF, nous pouvons extraire les durées de vie de fluorescence par déconvolution dans l'ajustement des données. Grâce à des simulations, nous avons constaté que la déconvolution peut extraire avec précision les durées de vie de fluorescence jusqu'à IRF/5 (par exemple, IRF = 200 ps, la déconvolution peut s'ajuster avec précision jusqu'à ~40 ps). Actuellement, certains fabricants d'instruments commerciaux fixent la limite de la déconvolution à IRF/10 et la définissent comme la résolution temporelle de l'instrument, ce qui me semble exagéré et inexact. Après tout, les résultats de la déconvolution sont dérivés de méthodes mathématiques de projection, plutôt que d'une détection précise, et les résultats ne peuvent faire qu'une projection approximative de la durée de vie de la fluorescence inférieure à l'IRF. Pour une détection plus précise, il convient d'utiliser un équipement de détection doté d'une résolution temporelle plus élevée, tel que la conversion ascendante de fluorescence ultrarapide et les caméras à balayage ultrarapides.

En outre, il convient de souligner à nouveau que la résolution temporelle de la technique de détection de la durée de vie de la fluorescence est déterminée par le temps IRF du système dans son ensemble, et non par le temps bin dans la courbe de durée de vie de la fluorescence (∆t dans la figure 1) ou par la précision de synchronisation micro-temporelle de la carte TCSPC. **Le ∆t et la précision temporelle reflètent uniquement la résolution temporelle de la carte TCSPC, et non l'IRF de l'ensemble du système de détection de la fluorescence, y compris le laser et le détecteur, étant donné que l'IRF du laser et du détecteur est généralement beaucoup plus importante que la précision temporelle du TCSPC, et que l'IRF de l'ensemble du système est limitée par le laser et le détecteur.

Actuellement, les dispositifs de détection de la durée de vie de la fluorescence disponibles dans le commerce offrent des options avec différentes configurations telles que des lasers et des détecteurs.En résumé, pour le paramètre de la résolution temporelle, il convient de se concentrer sur les points suivants lors du choix de la configuration de l'instrument :

• Quelle est la largeur d'impulsion du laser ?
• temps de gigue du signal de synchronisation du laser
• Temps de gigue du détecteur
• Précision de la synchronisation de la carte du CTPC, nombre de canaux et autres informations

L'IRF final du système sera supérieur ou égal à la valeur maximale du temps dans les paramètres ci-dessus.

2) Fenêtre temporelle de détection et fréquence de répétition du laser

La plage de la fenêtre temporelle pour la détection de la durée de vie de la fluorescence de la TCSPC dépend principalement de la fréquence du laser, la plage maximale de la fenêtre temporelle étant le temps de cycle de la fréquence du laser T. Toutefois, en raison du retard dans la transmission du signal électrique, comme le montre la figure 3, une partie de la plage de la fenêtre temporelle est occupée par le temps de retard. D'une manière générale, la plage de la fenêtre temporelle doit être sélectionnée pour être au moins 2 à 3 fois plus grande que la durée de vie de la fluorescence, il est donc nécessaire de sélectionner la fréquence de répétition du laser appropriée et d'ajuster le délai du signal électrique en fonction de la durée de vie de la fluorescence de l'échantillon. En outre, si le TCSPC détermine le temps d'échantillonnage (∆t) de la courbe de durée de vie de la fluorescence en divisant la plage de la fenêtre temporelle par le nombre de canaux, alors si la fenêtre temporelle est trop grande, la valeur du temps d'échantillonnage augmentera (par exemple, ∆t ≈ ou > IRF), ce qui entraînera une diminution de la résolution temporelle du système.

D'autre part, pour la méthode d'acquisition par comptage de photons uniques TCSPC, l'utilisation d'un laser avec une fréquence de réémission trop faible signifie que le nombre de photons acquis par unité de temps est faible, ce qui réduira sérieusement l'efficacité de l'acquisition de la courbe de durée de vie de la fluorescence ainsi que le rapport signal/bruit.

04Affichage correct des courbes de durée de vie de la fluorescence

Comme indiqué ci-dessus, une courbe complète de durée de vie de la fluorescence doit comprendre des fronts ascendants et descendants. Les deux parties sont physiquement importantes. Il est courant de voir certaines données sur la durée de vie de la fluorescence présentées dans la littérature qui omettent le bord ascendant, ce qui est intrinsèquement incorrect. Le front montant représente le processus de génération de l'état excité de l'échantillon, car l'excitation directe des espèces luminescentes peut refléter la taille de l'IRF au moment de la détection, ce qui peut être utilisé pour déterminer si la courbe de durée de vie de la fluorescence ne comporte pas la possibilité de composantes de décroissance rapide, et peut également être utilisé pour observer certains des échantillons dans le processus de transfert d'énergie et d'autres processus (ou d'autres processus de génération de l'état excité), comme le montre la figure 8, et il convient donc d'y accorder suffisamment d'attention. Bien entendu, si la durée de vie de la fluorescence est beaucoup plus grande que l'IRF ou s'il n'est pas nécessaire de prêter attention aux processus rapides, il est également possible d'ignorer le front montant. En outre, l'IRF doit également être pris en compte dans l'ajustement de la courbe de durée de vie de la fluorescence (en particulier lorsque la durée de vie de la fluorescence est courte) afin d'obtenir des résultats d'ajustement de la durée de vie de la fluorescence plus précis.

Pendant le transfert d'énergie par résonance entre le donneur et l'accepteur, le processus cinétique du transfert d'énergie peut être évalué en rassemblant les courbes de durée de vie de la fluorescence des deux. Si le temps de transfert d'énergie > IRF, la courbe de durée de vie de la fluorescence de l'accepteur présente un front ascendant plus lent que l'IRF, accompagné d'une décroissance rapide de la fluorescence du donneur.

Source : Tristar Spectrum@WeChat
Le temps :2022-04-19